天然細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成涉及化學(xué)環(huán)境、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)機(jī)制之間復(fù)雜的相互作用，在制備某些特殊蛋白時(shí)會面臨諸多挑戰(zhàn)，比如膜蛋白的低表達(dá)量、毒性蛋白的細(xì)胞致死效應(yīng)以及需要復(fù)雜翻譯后修飾蛋白的功能缺失等。這些"難表達(dá)蛋白"的制備瓶頸嚴(yán)重制約了相關(guān)基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的發(fā)展。

無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)（Cell-Free Protein Synthesis, CFPS）通過重構(gòu)體外轉(zhuǎn)錄翻譯體系，在人工和無細(xì)胞環(huán)境中復(fù)制這種相互作用可以控制蛋白質(zhì)合成的精度，為這類"頑固分子"的制備開辟了新路徑。

圖1:無細(xì)胞蛋白表達(dá)概述圖

無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)通過提取細(xì)胞裂解物中的核心生物元件，構(gòu)建開放式的體外合成系統(tǒng)。該技術(shù)突破傳統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)的物理邊界：

1.細(xì)胞膜屏障的消解：通過物理破碎細(xì)胞釋放核糖體、轉(zhuǎn)錄因子等核心元件，消除細(xì)胞膜對大分子底物的通透性限制。

2.代謝網(wǎng)絡(luò)的解耦重構(gòu)：將能量再生系統(tǒng)（如磷酸肌酸/肌酸激酶）、氨基酸供給、核苷酸循環(huán)等模塊獨(dú)立優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)代謝通量的精準(zhǔn)調(diào)控。

1.膜蛋白：跨越脂雙層的表達(dá)革命

膜蛋白在細(xì)胞生物學(xué)和生物技術(shù)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，從細(xì)胞信號傳導(dǎo)到治療發(fā)現(xiàn)。然而，膜蛋白 （MP） 很難在大腸桿菌等異源菌株中表達(dá)，必須使用修飾菌株，有時(shí)菌株會產(chǎn)生包涵體，這使得純化變得困難。鑒于膜蛋白合成的復(fù)雜性和對蛋白質(zhì)-脂質(zhì)-化學(xué)相互作用的有限理解，一種設(shè)計(jì)人工合成條件的方法至關(guān)重要。

無細(xì)胞體系通過創(chuàng)新策略實(shí)現(xiàn)膜蛋白表達(dá)的突破——納米盤（Nanodisc）技術(shù)：一種由磷脂雙層構(gòu)成的微型圓盤結(jié)構(gòu)，提供與天然細(xì)胞膜更接近的磷脂雙分子層環(huán)境，能夠高度模擬細(xì)胞膜的天然環(huán)境；有利于膜蛋白形成正確的天然構(gòu)象，可以更好的維持膜蛋白構(gòu)象穩(wěn)定，有利于下游純化。

圖2:CFPS+Nanodisc表達(dá)情況

2. 毒性蛋白：突破細(xì)胞耐受的極限

毒性蛋白因具備破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、干擾代謝過程或直接殺傷宿主細(xì)胞的能力，在傳統(tǒng)表達(dá)純化系統(tǒng)中面臨多重技術(shù)瓶頸，比如BamHI限制性內(nèi)切酶在傳統(tǒng)大腸桿菌系統(tǒng)中過表達(dá)時(shí)，其DNA切割活性會抑制宿主生長，表達(dá)量極低且難以獲得有活性的目的蛋白。

無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)（CFPS）通過體外開放體系規(guī)避了傳統(tǒng)系統(tǒng)的局限性：

√無細(xì)胞毒性：裂解物已失去生命活性，毒性蛋白無法損傷宿主；

√開放式控制：可實(shí)時(shí)調(diào)整反應(yīng)條件（如添加分子伴侶）優(yōu)化蛋白折；

√簡化純化：反應(yīng)液中雜質(zhì)少，目標(biāo)蛋白純度更高，且支持一步親和純化；

√高通量能力：支持多孔板或微流控芯片上的并行表達(dá)，加速毒性蛋白變體的篩選與優(yōu)化。

應(yīng)用實(shí)例：珀羅汀生物在自研無細(xì)胞體系中成功表達(dá)出BamHI限制性內(nèi)切酶，如圖3A所示；并證明了PLD無細(xì)胞蛋白表達(dá)的BamHI限制性內(nèi)切酶具有活性，如圖B所示（2,3,4,5泳道對應(yīng)的質(zhì)粒被切成線性模版，Z低濃度為 0.001 ug/uL即可顯示酶切活性）。

圖3:BamHI限制性內(nèi)切酶在PLD無細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)

3.  非天然氨基酸：重塑蛋白研究領(lǐng)域

天然氨基酸的種類數(shù)量存在一定局限，且其化學(xué)結(jié)構(gòu)相對保守。基于天然氨基酸構(gòu)建的天然蛋白質(zhì)，在應(yīng)對蛋白質(zhì)工程以及蛋白藥物開發(fā)等領(lǐng)域的復(fù)雜研究需求時(shí)，難以提供全面且有效的支持。而非天然氨基酸（ nnAAs）擁有豐富多樣的側(cè)鏈基團(tuán)結(jié)構(gòu)。當(dāng)把其引入蛋白質(zhì)中時(shí)，能夠?yàn)榈鞍踪|(zhì)帶來全新的化學(xué)特性、空間結(jié)構(gòu)以及特殊的功能表現(xiàn)，為生物研究、生物治療學(xué)以及合成生物學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域提供了全新的探索方向和研究方法。

與細(xì)胞蛋白表達(dá)相比，無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)在非天然氨基酸插入領(lǐng)域具有天然優(yōu)勢：

√ 無細(xì)胞系統(tǒng)沒有細(xì)胞膜阻礙，規(guī)避了nnAAs選擇性問題；

√無細(xì)胞系統(tǒng)不受nnAAs可能產(chǎn)生的細(xì)胞毒性作用影響；

√有利于精細(xì)調(diào)控反應(yīng)進(jìn)程。

應(yīng)用實(shí)例：珀羅汀生物對綠色熒光蛋白（GFP）進(jìn)行非天然氨基酸定點(diǎn)插入，在CFPS體系中成功表達(dá)了含非天然氨基酸（pAcF/pAzF）的GFP，其中pAcF插入效率超過70%，如圖4所示。

圖4:PLD無細(xì)胞系統(tǒng)中非天然氨基酸插入

隨著AI技術(shù)的融入，無細(xì)胞體系正向智能化方向演進(jìn)，未來，無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)與人工智能的深度融合將引生物制造領(lǐng)域邁向全新高度，催生“智能、靈活、綠色"的蛋白生產(chǎn)新范式。一方面，AI將貫穿蛋白設(shè)計(jì)、反應(yīng)優(yōu)化到質(zhì)量控制的全鏈條，通過海量數(shù)據(jù)訓(xùn)練與實(shí)時(shí)反饋機(jī)制，實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)流程的自動化與精準(zhǔn)化，顯著縮短研發(fā)周期并降低成本；另一方面，無細(xì)胞系統(tǒng)的開放性與模塊化特性，將與AI驅(qū)動的分布式生產(chǎn)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合，構(gòu)建去中心化的“蛋白智造工廠"，使個(gè)性化醫(yī)療、現(xiàn)場應(yīng)急合成等場景成為現(xiàn)實(shí)。

圖5:使用條件語言建模的人工蛋白質(zhì)生成

1. Garenne, D., et al., Cell-free gene expression. Nature Reviews Methods Primers, 2021. 1(1): p. 49.

2. Silverman, A.D., A.S. Karim and M.C. Jewett, Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics, 2020. 21(3): p. 151-170.

3. González-Ponce, Karen Stephania et al. Cell-Free Systems and Their Importance in the Study of Membrane Proteins.The Journal of membrane biology vol. 258,1 (2025): 15-28.

4. Manzer ZA, Selivanovitch E, Ostwalt AR, Daniel S. Membrane protein synthesis: no cells required. Trends Biochem Sci. 2023 Jul;48(7):642-654.

5. Gulezian E, Crivello C, Bednenko J, Zafra C, Zhang Y, Colussi P, Hussain S. Membrane protein production and formulation for drug discovery. Trends Pharmacol Sci. 2021 Aug;42(8):657-674.

6. Hedin, L. E., Illerg?rd, K. & Elofsson, A. An introduction to membrane proteins. J. Proteome Res.10, 3324–3331 (2011).

7. Madani, Ali et al. “Large language models generate functional protein sequences across diverse families." Nature biotechnology vol. 41,8 (2023).